規(guī)?；诌x“純凈”種子細(xì)胞的新方法
中國(guó)是世界人口大國(guó)，因創(chuàng)傷、疾病、遺傳、衰老等因素造成的組織和器官缺損、衰竭或功能障礙的患者人數(shù)位居世界各國(guó)，以藥物和手術(shù)治療為基本支柱的經(jīng)典醫(yī)學(xué)治療手段，已不能滿足臨床醫(yī)學(xué)的巨大需求。細(xì)胞治療可以通過(guò)移植對(duì)應(yīng)組織的細(xì)胞來(lái)修復(fù)發(fā)生了病變、衰老或損傷的組織器官，從而更新其生理功能，為組織器官缺損所致的疾病提供全新的治療手段。但是，這種方法需要有足夠數(shù)量對(duì)應(yīng)類型的細(xì)胞，通過(guò)常規(guī)的捐獻(xiàn)方法很難達(dá)到臨床上對(duì)數(shù)量和類型的要求，因而面臨著細(xì)胞來(lái)源短缺的嚴(yán)重問(wèn)題，這在很大程度上阻礙了細(xì)胞治療的發(fā)展步伐。干細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下能夠維持自我更新，還能夠被誘導(dǎo)成為機(jī)體幾乎所有細(xì)胞類型，因而可以為臨床疾病的細(xì)胞治療提供重要的種子資源細(xì)胞。特別是間充質(zhì)干細(xì)胞的出現(xiàn)，其具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，因取材方便、體內(nèi)植入后不良反應(yīng)較弱等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注，成為細(xì)胞替代治療的理想種子細(xì)胞，在細(xì)胞治療中有更廣闊的應(yīng)用前景。
統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞可用于治療自身免疫病、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨骼及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)等多種疾病，且近年來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞用于疾病治療的案例逐年增加，并有顯著效果，因而推動(dòng)間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用是對(duì)人類健康做出重大貢獻(xiàn)的舉措。除此之外，胚胎干細(xì)胞（ES）和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPS）通過(guò)誘導(dǎo)都能夠分化成為不同類型的細(xì)胞，都是細(xì)胞治療潛在的種子細(xì)胞。但是，在誘導(dǎo)分化過(guò)程中由于細(xì)胞分化程度不一，因而獲得特定分化階段的細(xì)胞對(duì)臨床轉(zhuǎn)化中的療效和安全性都有重要意義。在這種情況下，如何較快獲得高質(zhì)量、足數(shù)量的目的細(xì)胞成為細(xì)胞治療亟待解決的問(wèn)題。
那么，如何解決這個(gè)問(wèn)題，以推動(dòng)間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用呢？長(zhǎng)期探索該問(wèn)題的中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的研究團(tuán)隊(duì)將這個(gè)問(wèn)題分解為3個(gè)部分：細(xì)胞來(lái)源、細(xì)胞質(zhì)量以及細(xì)胞獲取方式。
在細(xì)胞來(lái)源方面，間充質(zhì)干細(xì)胞可從多種組織中獲取，但迄今為止，臍帶仍是的細(xì)胞來(lái)源。臍帶是胎兒與母體之間的紐帶，這股紐帶在分娩后通常被當(dāng)做生物垃圾處理。但臍帶中蘊(yùn)含著豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，且使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不會(huì)對(duì)母體和胎兒產(chǎn)生任何傷害。在細(xì)胞質(zhì)量方面，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床應(yīng)用中體現(xiàn)出其他來(lái)源干細(xì)胞所不具備的*性，包括免疫原性低、副作用小等，是細(xì)胞治療的高質(zhì)量選擇。在細(xì)胞獲取方式方面，目前臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞主要通過(guò)組織塊貼壁法獲得，但是這種方法需要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間，而且操作過(guò)程復(fù)雜，從得到臍帶到zui終收獲細(xì)胞通常需要14~22天，妨礙了細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用。
為了促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程和細(xì)胞治療中的應(yīng)用，科研工作者提出了許多新的細(xì)胞分選策略，以提高細(xì)胞的分選效率：除了目前較為流行的流式細(xì)胞術(shù)和免疫磁珠法外，還有基于細(xì)胞大小和密度的分選方法、基于沉降作用的分選方法以及發(fā)展的基于核酸識(shí)別細(xì)胞表面抗原的分選方法等，但這些方法或是分選純度不高，或是操作復(fù)雜、成本較高、對(duì)儀器依賴性強(qiáng)等，均不適用于大規(guī)模分選細(xì)胞。另外，流式細(xì)胞術(shù)中應(yīng)用了熒光素標(biāo)記抗體，分選后熒光素的存在會(huì)影響細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)，而免疫磁珠法分選的細(xì)胞磁珠仍殘留在細(xì)胞上，也會(huì)造成一定的細(xì)胞毒性，雖然有些磁珠分選方法可通過(guò)酶消化zui終除去磁珠，但酶消化的同時(shí)也會(huì)破壞細(xì)胞表面抗原分子的結(jié)構(gòu)。面對(duì)細(xì)胞分選技術(shù)面臨的種種問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)希望研制出簡(jiǎn)單、快速、有效、無(wú)損、可逆，能夠規(guī)?；@取間充質(zhì)干細(xì)胞并且不影響細(xì)胞的生存率和生物功能的細(xì)胞分選方法，目前已初步找到了兩種潛力的方案。
研究團(tuán)隊(duì)的*種方案利用了海藻酸和生物素-親合素系統(tǒng)（Biotin-Avidin System，BAS）。海藻酸是一種天然多聚糖，是構(gòu)成海藻的細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)的主要成分；它屬于陰離子型共聚物，可以與金屬離子結(jié)合形成各種海藻酸鹽，具有良好的生物相容性與低毒性，而且具有很強(qiáng)的成膠能力，工業(yè)上將海藻酸及其衍生物產(chǎn)品統(tǒng)稱為海藻膠或褐藻膠。除海藻酸外，商業(yè)上有實(shí)用價(jià)值的海藻酸衍生物為水溶性的海藻酸鹽，包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸鈣、海藻酸銨、海藻酸丙二醇酯等，其中海藻酸鈉是制備多種海藻酸衍生物的*前體。
海藻酸鈉屬于陰離子多糖，其溶液可以與多種物質(zhì)混溶，同時(shí)也很容易與除鎂離子以外的高價(jià)陽(yáng)離子、陽(yáng)離子表面活性劑及強(qiáng)酸鍵合形成凝膠沉淀，且形成的凝膠結(jié)構(gòu)具有熱不可逆性。但通過(guò)改變pH值和加入螯合物等條件可以使凝膠解聚，瓦解凝膠結(jié)構(gòu)，改變這種不可逆性。當(dāng)離子螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）存在時(shí)，鈣離子與EDTA結(jié)合，海藻酸鈣凝膠失去鈣離子而解聚，重新形成水溶性的海藻酸。根據(jù)這一可逆過(guò)程，研究團(tuán)隊(duì)制備了海藻酸修飾的磁性納米顆粒，形成了細(xì)胞無(wú)損可逆分選的基礎(chǔ)之一。
生物素-親合素系統(tǒng)是20世紀(jì)70年代末發(fā)展起來(lái)的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素環(huán)形結(jié)構(gòu)中的Ⅰ環(huán)為咪唑酮環(huán)（又稱Ureido環(huán)），是與親合素結(jié)合的主要部位；生物素的Ⅱ環(huán)結(jié)構(gòu)為噻吩環(huán)，帶有一個(gè)戊酸側(cè)鏈，末端羧基是標(biāo)記抗體和酶的*結(jié)構(gòu)。由于生物素分子很小，因而抗體分子和酶經(jīng)生物素化后，仍能保持其原有活力不變；細(xì)胞經(jīng)生物素化后仍能保持正常的分裂、增殖能力，因此生物素常作為抗體、酶和細(xì)胞的標(biāo)記。生物素-親合素系統(tǒng)的高度特異性、高度靈敏性是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞無(wú)損可逆分選的另一基礎(chǔ)。
在基于海藻酸的自組裝和生物素-親和素系統(tǒng)的細(xì)胞分選方法中，研究團(tuán)隊(duì)首先將海藻酸用鏈酶親和素標(biāo)記，并將其修飾在海藻酸包裹的磁性納米顆粒上，然后對(duì)靶標(biāo)分子的抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記；當(dāng)抗體與細(xì)胞孵育并結(jié)合到相應(yīng)細(xì)胞表面標(biāo)志物上后，再與鏈酶親和素修飾的磁性納米顆粒孵育，通過(guò)生物素-親和素系統(tǒng)的特性將細(xì)胞與磁性納米顆粒鏈接；zui后在磁性富集得到的目的細(xì)胞中加入EDTA，使海藻酸鈣瓦解、磁珠從細(xì)胞上釋放，即可得到不含磁珠的目的細(xì)胞（見(jiàn)圖1）。該步驟可使用不同抗體重復(fù)進(jìn)行，直至得到目的細(xì)胞。
通過(guò)這種方法，研究團(tuán)隊(duì)成功從臍帶中分離得到了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，分選效率高達(dá)90%（見(jiàn)圖2），得到的細(xì)胞數(shù)目為每厘米150萬(wàn)~200萬(wàn)個(gè)，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)組織塊貼壁法所得到的細(xì)胞數(shù)目（每厘米2.5萬(wàn)～25萬(wàn)個(gè)），且得到的細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)能夠分化為骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞
研究團(tuán)隊(duì)的另一種方案利用了生物素/D-脫硫生物素與鏈霉親和素的結(jié)合能力差異，被稱為“基于生物素/D-脫硫生物素素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素的細(xì)胞分選方法”。D-脫硫生物素是生物機(jī)體合成生物素的原料，是不含硫的生物素類似物，其與親和素的結(jié)合能力是生物素的十萬(wàn)分之一，因而當(dāng)D-脫硫生物素與親和素結(jié)合時(shí)能夠在溫和的條件下被生物素競(jìng)爭(zhēng)取代，從而保證被分選細(xì)胞和大分子的完整性。
與生物素一樣，親和素上同樣也有4個(gè)D-脫硫生物素的結(jié)合位點(diǎn)，因而可利用生物素-親和素系統(tǒng)級(jí)聯(lián)放大信號(hào)的作用，將傳統(tǒng)的免疫磁珠細(xì)胞分選方法進(jìn)行改良，使細(xì)胞表面的抗原放大，更易于被捕獲；此外，有些細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)量較低，也可通過(guò)這種級(jí)聯(lián)放大提高捕獲效率。
該方法的實(shí)施過(guò)程為：將靶標(biāo)分子的抗體用D-脫硫生物素進(jìn)行標(biāo)記后與細(xì)胞孵育，通過(guò)抗原-抗體結(jié)合捕獲目的細(xì)胞，將其與親和素標(biāo)記的磁珠進(jìn)行孵育，使細(xì)胞富集到磁珠上，磁性富集即可分離目的細(xì)胞，zui后通過(guò)與生物素孵育使細(xì)胞從磁珠上釋放，得到不含磁珠的目的細(xì)胞（見(jiàn)圖4）。該方法無(wú)須使用熒光素標(biāo)記抗體和抗體標(biāo)記磁珠，避免了熒光素和磁珠可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，為細(xì)胞的后續(xù)增殖和使用提供了質(zhì)量保障。除此之外，該方法獲得的細(xì)胞不僅不含磁珠，而且細(xì)胞上的殘留物更少，在保證目的細(xì)胞表面蛋白不受破壞的前提下，為獲得“純凈”的細(xì)胞提供了新的思路。
基于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床應(yīng)用中顯示出的其他干細(xì)胞*的*性，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)該方法的實(shí)際可行性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的免疫磁珠分選法相比，采用該方法分選得到的細(xì)胞增殖效率沒(méi)有明顯差別（見(jiàn)圖5）。
研究團(tuán)隊(duì)綜合利用海藻酸的自組裝、生物素、D-脫硫生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合鏈霉親和素、生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)，旨在建立細(xì)胞無(wú)損可逆分選的新策略，為快速、簡(jiǎn)便地獲得數(shù)量足夠、質(zhì)量均一的臨床級(jí)細(xì)胞提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)，推動(dòng)干細(xì)胞應(yīng)用的臨床轉(zhuǎn)化。綜合看來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)建立并驗(yàn)證的兩種方法能夠簡(jiǎn)便、快速地獲得目的細(xì)胞，可以滿足臨床上短期內(nèi)對(duì)特定類型細(xì)胞的大量需求，具有重要的實(shí)用價(jià)值；同時(shí)還能為基礎(chǔ)研究中獲得特定階段、特定類型的細(xì)胞提供技術(shù)支撐，節(jié)約時(shí)間和成本。因而，這兩種方法對(duì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用轉(zhuǎn)化均有重要的參考價(jià)值。
基于在無(wú)損、可逆分選細(xì)胞方法方面的進(jìn)展和突破，研究團(tuán)隊(duì)將繼續(xù)進(jìn)行探索和研究，圍繞“簡(jiǎn)單、快速地獲得不含任何外源物（包括抗體）的目的細(xì)胞”這一*目標(biāo)，在后續(xù)工作中開(kāi)發(fā)出更好的技術(shù)與設(shè)備，為推動(dòng)干細(xì)胞的理論研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供先進(jìn)的
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